乙醇提取法制备大豆异黄酮

　　以乙醇水溶液提取大豆异黄酮具有提取率较高、无毒、溶剂可回收等优点，是提取大豆异黄酮的主要方法之一。
　　(1）工艺流程
　　(2）主要步骤
　　① 提取  将脱脂大豆粕用8～20倍体积的8％乙醇浸泡提取2～3次，提取温度为60～90℃，每次提取1.0～1.5h。
　　② 分离  提取完成后过滤，收集滤液进行真空浓缩，获得大豆异黄酮粗提取物浸膏，其可溶性固形物浓度约为18％。大豆异黄酮粗提取物的收得为0.625％，占脱脂豆粕大豆异黄酮含量的90％以上。滤渣挥发乙醇后用于制备大豆分离蛋白或大豆肽。
　　③ 萃取  向大豆异黄酮浸膏中加入等体积正己烷，进行萃取脱脂2次。分液后上层正己烷相用于回收并制备大豆油脂，下层水相用稀盐酸调节其pH值为4～5，然后用离心机离心，除去其中的蛋白质，获得脱蛋白大豆异黄酮粗提取液。
　　④ 吸附树脂活化  取XAD-4吸附树脂，先用乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗涤至无乙醇后用2～3倍体积的浓度为5％的盐酸浸泡1～1.5h ，再以2倍树脂体积／h的流速通过树脂。放出盐酸溶液后，泵入去离子水，以2～3倍树脂体积／h的流速洗涤树脂，直至流出液pH值接近中性时止。
向树脂柱内泵入2～3倍树脂体积的浓度为2％的NaOH溶液，浸泡处理1～1.5h，再以约2倍树脂体积／h的流速通过树脂，放出氢氧化钠溶液后，泵入去离子水，以2～3倍树脂体积／h 的流速洗涤树脂，直至流出液pH值接近中性时止。
　　⑤ 上柱吸附  取树脂体积1～1.5倍的脱蛋白大豆异黄酮粗提取液，升温至40℃后上柱，控制流出液速度为1～2倍树脂体积／h，使大豆异黄酮吸附于树脂上。然后泵入25℃左右的去离子水洗涤树脂，除去糖及其他水溶性杂质。
　　⑥ 洗脱  向树脂柱泵入温度为55～60℃去离子水，控制流出液速度为1～1 .5倍树脂体积／h，洗脱大豆异黄酮，以紫外检测器检测，收集在320～360nm 有明显吸收的洗脱液进行浓缩。洗脱大豆异黄酮的XAD-4吸附树脂，用2～3倍树脂体积的95％乙醇进行再生，然后用水洗涤至无乙醇味，获得再生树脂，可再次用来吸附大豆异黄酮。
　　⑦ 浓缩  将洗脱液进行减压浓缩成浓缩液，浓缩条件为温度95～100℃，真空度为一0.09～一0.08MPa。向浓缩液中加入等体积丙酮萃取2～3次，萃取温度为60℃。然后用离心机离心，收集离心液，减压回收丙酮后获得淡黄色大豆异黄酮，其收得率约为0.506％。
　　(3）主要指标
　　浅黄色粉末，大豆异黄酮含量70.56％，异黄酮中大豆昔比例为44.66％，染料木黄酮苷比例为55.34％。
　　实例44  大豆异黄酮苷元制备
　　将大豆异黄酮在高温及酸作用下水解，然后进行分步结晶，获得大豆异黄酮苷元。
　　(1）工艺流程
　　(2）主要步骤
　　① 提取  向脱脂大豆粕中加入5～6 倍体积的丙酮酸性溶液（用0.lmol / L 乙酸调节pH值至4.5）保持40～50℃，搅拌提取2次，每次2h。过滤，滤渣用少量混合液提取2～3次，再次过滤，收集合并滤液。
　　② 浓缩、水解  将滤液在40℃ 、真空度为一0.09～一0.08MPa下进行减压回收丙酮，获得粗提取固体。然后用10～20倍50％乙醇溶解，然后升温至80℃，在回流条件下处理15h左右，使大豆异黄酮水解成异黄酮苷。
　　③ 浓缩  将水解产物进行真空减压浓缩，回收乙醇，其温度为80～95℃ 、真空度为一0.1 ～一0.08MPa，直至浓缩液中无乙醇味时止。脱乙醇后获得浓缩液，将其过滤，收集滤液上柱精制。
　　④ 吸附  将色谱用聚酰胺装柱，然后将滤液泵入色谱柱，控制流出液速度为每小时1～2倍树脂体积，用紫外检测器检测流出液，直至有显著吸收时止，使聚酰胺达到饱和吸附。
　　⑤ 洗脱  吸附完成后，用去离子水洗涤吸附柱，直至流出液无色时止。然后用约2倍柱体积70％乙醇以每小时1～2倍树脂体积的流速通过色谱柱，洗脱异黄酮苷，直至洗脱液中无明显紫外吸收时止
　　⑥ 结晶  收集有明显紫外吸收的洗脱液，洗脱液中异黄酮苷的含量约为25％，大豆中异黄酮的收得率约95％。向洗脱液中加入适量20％硫酸，调节洗脱液乙醇浓度大于50％，硫酸浓度约为4.5％～5％。然后于80℃水浴上水解20h后冷却至常温，用浓度为10％氢氧化钠溶液中和，静置1h左右过滤。收集滤液进行减压浓缩，浓缩温度为65℃，真空度为一0 .1～一0.08MPa，浓缩至无乙醇味时止。静置12h后过滤，用去离子水洗涤沉淀，除去残留的硫酸钠。将沉淀置于60℃烘箱中干燥，获得大豆异黄酮苷元结晶粗品，其含量为35％～45％。
　　将异黄酮苷元粗品用少量50％丙酮溶解，在50～60℃水浴中搅拌回流处理约1.5h。过滤，收集滤液减压浓缩至干，获得纯度大于45％的异黄酮苷元产品。将该部分纯化的异黄酮苷元依次用60％、70％、80％的丙酮溶解及回流处理，回收丙酮并过滤，重复以上操作。获得滤液，冷却后置于4℃冰箱中结晶18h以上。过滤，收集晶体用水洗涤，在60℃烘干，获得异黄酮苷元含量为85％以上的产品。最后进行分步结晶，获得大豆素结晶和染料木素结晶。
　　(3）主要指标
　　产品中大豆素含量≥95％，染料木素含量≥95％。
　　鞠兴荣等用70％乙醇溶液制备大豆异黄酮，获得极性较强的异黄酮苷元含量占95％以上、极性较低的异黄酮苷元含量小于5％的产品。